Clonación y expresión heteróloga del gen de lipasa lpsa01 de pseudomonas aeruginosa psa-01 aislada de frutos de palma aceitera

Abstract

Las lipasas de origen microbiano son biocatalizadores versátiles de gran potencial de aplicación a nivel industrial. El grupo de Investigación de Procesos Agroindustriales (GIPA) de la Universidad de la Sabana ha aislado, caracterizado y purificado parcialmente la lipasa LSPSA-01 de Pseudomonas aeruginosa PSA-01, la cual se ha encontrado promisoria para la catálisis de reacciones de esterificación para la producción de biodiesel desde aceite de palma y metanol 1. Esta lipasa mostró buena actividad a 58°C, tolerancia a pH alcalinos y no perdió su actividad en solventes tales como hexano, heptano, DMSO y etanol 2. Por las propiedades mencionadas y en búsqueda de mejorar los rendimientos de producción de la lipasa LSPSA-01, para su posterior purificación y caracterización bioquímica. El presente trabajo tiene por objetivo obtener la lipasa LPSA01 mediante estrategias de producción heteróloga, para evaluar su actividad y rendimientos de producción. El gen de la lipasa, lipA (936 bp) y el gen de la foldasa, lipH (867 bp) de Pseudomonas aeruginosa PSA01 se identificaron y se secuenciaron, encontrándose idénticos en un 99% y 100% con los genes de lipA y lipH, de P. aeruginosa PAO1, P. aeruginosa LST03 y P. aeruginosa CS-2, respectivamente. Se construyó exitosamente el sistema de expresión Escherichia coli SHuffle/pET29a-lipA. La actividad de lipasa obtenida con este sistema se encontró para el cultivo inducido a una densidad óptica de 0.4 Abs a 600 nm, con una concentración de IPTG de 0.4mM y temperatura de expresión 25°C, en la fracción soluble de lisis, la cual correspondió a 8000 U/L. La LipA activa se logró obtener sin la coexpresión de LipH, sin embargo, la mayor concentración de lipasa recombinante se acumula en cuerpos de inclusión inactiva.

Microbial lipases are versatile biocatalyst with great industrial potential. The Agroindustrial Processes research group from the University of La Sabana has isolated, partially purified and characterized the LSPSA-01 lipase from Pseudomonas aeruginosa PSA-01. The enzyme was found to be suitable for the catalysis of esterification reactions for the biodiesel production from palm oil and methanol 1 . The lipase showed desirable activity at 58°C and was stable at alkaline pH. The lipase remains active in the presence of hexane, heptane, DMSO and ethanol 2 . Therefore, in order to increase the yield of production of the enzyme for later purification and characterization, and efficient heterologous expression system is desirable. The lipase gene, lipA (936 bp) and the foldase gene, lipH (867 bp) of Pseudomonas aeruginosa PSA01 were sequenced and resulted 99% and 100% identical with the lipA and lipH genes from P. aeruginosa PAO1, P. aeruginosa LST03 and P. aeruginosa CS-2, respectively. In this study, we report the construction of the Escherichia coli SHuffle / pET29a-lipA expression system and the subsequent production of the lipase. The lipase activity was found in the soluble fraction of cell lysis, which corresponded to 8000 U / L. Active LipA was obtained without the coexpression of LipH, for the culture induced at an optical density of 0.4Abs at 600 nm, with an IPTG concentration of 0.4mM and an expression temperature of 25 °C, offering promising strategies for overproduction. However, the highest concentration of recombinant lipase accumulates in inactive inclusion bodies.