Modificación del gen lipA codificante de la lipasa de pseudomonas aeruginosa PSA01 dirigida a la alteración de su selectividad hacia ácidos grasos de diferente longitud de cadena

Abstract

La lipasa LipA de Pseudomonas aeruginosa se caracteriza por hidrolizar un amplio rango de ácidos grasos esterificados en los triacilgliceroles, desde los de 4 carbonos, hasta aquellos con 20 carbonos. En esta investigación se buscó reducir el rango de sustratos de la enzima hacia la hidrólisis de ácidos grasos de longitud de cadena determinados. Las lipasas quimio selectivas son industrialmente interesantes pues favorecen la catálisis de ácidos grasos de longitudes de cadena específicos, en presencia de otros similares en la molécula, promoviendo su enriquecimiento o selección y disminuyendo pasos adicionales de purificación. En LipA se desconoce las estructuras del sitio activo relacionadas con su baja quimio preferencia, siendo necesario su identificación. Se utilizó así la técnica de epPCR para obtener mutantes con selectividad diferencial sobre ácidos grasos. Se establecieron las condiciones de cultivo para la expresión citoplasmática controlada y segura de lipA junto al gen lif codificante de su foldasa, en un constructo no evaluado y en E. coli BL21(DE3) y E. coli SHuffle, en los que la lipasa tiende a precipitarse. Diferencias fueron observadas en la actividad y estabilidad de las enzimas producidas por cada cepa, atribuibles probablemente a la formación del puente disulfuro en SHuffle. Con dinámica molecular se estableció que la ausencia de este enlace altera la estructura y flexibilidad de LipA, explicando dichas diferencias. Para la construcción de las librerías, pelB se fusionó a LipA direccionando su salida al sobrenadante en E. coli Rosetta (DE3) pLysS. Se identificaron 3 variantes en las librerías, una de las cuales, la G10, presentó mayor actividad hacia p-nitrofenil miristato que hacia p-nitrofenil palmitato y mayor hidrólisis hacia los ácidos grasos presentes en el aceite de coco, que los del aceite de oliva.