Modificación del gen lipA codificante de la lipasa de Pseudomonas aeruginosa PSA01 dirigida a la alteración de su selectividad hacia ácidos grasos de diferente longitud de cadena

Abstract

Lipase LipA from Pseudomonas aeruginosa is characterized by hydrolyzing a wide range of esterified fatty acids in triacylglycerols, from those with 4 carbons to those with 20 carbons. In this research, we sought to reduce the enzyme preference towards the hydrolysis of fatty acids of certain chain length. Chemo selective lipases are interesting industrially because they favor the catalysis of fatty acids of specific chain lengths, with other similar ones in the same molecule, promoting their enrichment or selection and reducing additional purification steps. In LipA, the structures of the active site related to its low chemo preference are unknown, and their identification is a must. Thus, a random mutagenesis method with the epPCR technique was used to obtain mutants with differential selectivity for fatty acids. Culture conditions were established for the controlled and safe cytoplasmic expression of lipA together with the lif gene, encoding the foldase essential for its folding, in a construct not previously evaluated for its expression in E

La lipasa LipA de Pseudomonas aeruginosa se caracteriza por hidrolizar un amplio rango de ácidos grasos esterificados en los triacilgliceroles, desde los de 4 carbonos, hasta aquellos con 20 carbonos. En esta investigación se buscó reducir el rango de sustratos de la enzima hacia la hidrólisis de ácidos grasos de longitud de cadena determinados. Las lipasas quimio selectivas son industrialmente interesantes pues favorecen la catálisis de ácidos grasos de longitudes de cadena específicos, en presencia de otros similares en la molécula, promoviendo su enriquecimiento o selección y disminuyendo pasos adicionales de purificación. En LipA se desconoce las estructuras del sitio activo relacionadas con su baja quimio preferencia, siendo necesario su identificación. Se utilizó así la técnica de epPCR para obtener mutantes con selectividad diferencial sobre ácidos grasos. Se establecieron las condiciones de cultivo para la expresión citoplasmática controlada y segura de lipA junto al gen lif codificante de su foldasa, en un constructo no evaluado y en E. coli BL21(DE3) y E. coli SHuffle, en los que la lipasa tiende a precipitarse.