@misc{10818/51818,
year = {26},
url = {http://hdl.handle.net/10818/51818},
abstract = {This study aimed to express heterologously the lipase LipA from Pseudomonas aeruginosa PSA01 obtained from palm fruit residues. In previous approaches, LipA was expressed in Escherichia coli fused with its signal peptide and without its disulfide bond, displaying low activity. We cloned the mature LipA with its truncated chaperone Lif in a dual plasmid and overexpressed the enzyme in two E. coli strains: the traditional BL21 (DE3) and the SHuffle® strain, engineered to produce stable cytoplasmic disulfide bonds. We evaluated the effect of the disulfide bond on LipA stability using molecular dynamics. We expressed LipA successfully under isopropyl β-d-1-thio-galactopyranoside (IPTG) and slow autoinducing conditions. The SHuffle LipA showed higher residual activity at 45 °C and a greater hyperactivation after incubation with ethanol than the enzyme produced by E. coli BL21 (DE3). Conversely, the latter was slightly more stable in methanol 50% and 60% (t½: 49.5 min and 9 min) than the SHuffle LipA (t½: 31.5 min and 7.4 min). The molecular dynamics simulations showed that removing the disulfide bond caused some regions of LipA to become less flexible and some others to become more flexible, significantly affecting the closing lid and partially exposing the active site at all times.},
abstract = {Este estudio tuvo como objetivo expresar heterólogamente la lipasa LipA de Pseudomonas aeruginosa PSA01 obtenida de residuos de frutos de palma. En enfoques anteriores, LipA se expresó en Escherichia coli fusionado con su péptido señal y sin su enlace disulfuro, mostrando una baja actividad. Clonamos el LipA maduro con su chaperona Lif truncada en un plásmido dual y sobreexpresamos la enzima en dos cepas de E. coli: la tradicional BL21 (DE3) y la cepa SHuffle®, diseñadas para producir enlaces disulfuro citoplasmáticos estables. Evaluamos el efecto del enlace disulfuro en la estabilidad de LipA usando dinámica molecular. Expresamos LipA con éxito en isopropil β-d-1-tio-galactopiranósido (IPTG) y en condiciones de autoinducción lenta. SHuffle LipA mostró una mayor actividad residual a 45 °C y una mayor hiperactivación después de la incubación con etanol que la enzima producida por E. coli BL21 (DE3). Por el contrario, este último fue ligeramente más estable en metanol al 50 % y al 60 % (t½: 49,5 min y 9 min) que el SHuffle LipA (t½: 31,5 min y 7,4 min). Las simulaciones de dinámica molecular mostraron que la eliminación del enlace disulfuro provocó que algunas regiones de LipA se volvieran menos flexibles y otras más flexibles, lo que afectó significativamente el cierre del párpado y expuso parcialmente el sitio activo en todo momento.},
publisher = {International Journal of Molecular Sciences},
keywords = {Pseudomonas aeruginosa lipase},
keywords = {Lipase LipA},
keywords = {Overexpression of E. coli SHuffle},
keywords = {Lipase and foldase overexpression},
keywords = {Expression of disulfide bond proteins},
title = {Functional Heterologous Expression of Mature Lipase LipA from Pseudomonas aeruginosa PSA01 in Escherichia coli SHuffle and BL21 (DE3): Effect of the Expression Host on Thermal Stability and Solvent Tolerance of the Enzyme Produce},
title = {Expresión heteróloga funcional de lipasa LipA madura de Pseudomonas aeruginosa PSA01 en Escherichia coli SHuffle y BL21 (DE3): efecto del huésped de expresión sobre la estabilidad térmica y la tolerancia a disolventes del producto enzimático},
doi = {10.3390/ijms21113925},
author = {Pulido, Ingrid Yamile and Prieto, Erlide and Gilles Paul Pieffet and Méndez, Lina and Jiménez Junca, Carlos A.},
}